Dopo un tentativo di furto nella casa dei genitori, il piccolo Peter viene affidato agli zii paterni, Ben e May Parker. Rimasto orfano a causa di un misterioso incidente dei suoi genitori, Peter cresce a casa degli zii. Dieci anni dopo è un ragazzo, con una forte passione per la scienza e la tecnologia, frequentante la Midtown Science High School.
Le sue giornate non sono sempre limpide, gli sporadici dispetti dei bulli,Flash Thompson in primis, e l'assenza di veri amici, hanno formato in lui quella vena di cinismo e sarcasmo che caratterizzeranno anche la sua eroica controparte. Fra gli studenti della scuola spicca Gwen Stacy, figlia del capo della polizia George Stacy, la quale nutre un amore per la scienza paragonabile al ragazzo e mostra un certo feeling e simpatia verso quest'ultimo fin da quando ha modo di conoscerlo. Un giorno, fra i vecchi oggetti impolverati della cantina, Peter ritrova fortuitamente una valigetta appartenuta a suo padre, scienziato e uomo alquanto misterioso, avendo finalmente modo di cominciare a far luce sulla scomparsa dei suoi genitori. Le ricerche lo conducono alla Oscorp Tower, dove lavora il brillante Curtis Connors, ex collega di suo padre mirante allo studio degli incroci fra specie. Peter, spinto dalla curiosità, si allontana ingenuamente dal gruppo di visitatori per esplorare indisturbato un laboratorio nel quale verrà morso da un ragno geneticamente modificato. Nonostante lo spaesamento e l'incomprensione iniziali, Peter impara ben presto ad amare e ad essere intrigato dai poteri acquisiti. Così, dopo aver testato le sue nuove capacità durante la ricerca dell'omicida sui cui grava la morte di suo zio, Peter fabbrica una tuta (realizzata in Spandex Elastam) e costruisce due lancia-ragnatele con il biocavo della Oscorp, facendosi presto conoscere per le strade di Manhattan come "Spider-Man". La situazione non resterà tranquilla a lungo, caos e timori inizieranno a pervadere i cittadini con la comparsa del bestiale e terrificante Lizard, alter ego del Dott. Connors, mutatosi per un'errata quanto frettolosa sperimentazione umana sul proprio corpo, sotto la pressione esercitata dal malato Norman Osborn.
Gli scontri che seguono tra Lizard e Spider-Man vedono vincitore quest'ultimo, ma il nemico riesce a scoprirne l'identità e attacca la scuola in cui studia il ragazzo. Peter lo segue nelle fogne e scopre il piano dello scienziato: utilizzare il siero sull'intera città e trasformare gli umani in lucertole, dando inizio ad una specie più evoluta, più forte, e più intelligente. Per compiere questo suo piano, Lizard connette il dispositivo alla Oscorp Tower, luogo in cui Spider-Man aveva mandato Gwen per poter creare un antidoto in grado di riportare alla normalità lo scienziato. Gwen crea l'antidoto e sfugge al mostro, ma Peter, braccato dalla polizia, viene smascherato dal capitano George Stacy. Quest'ultimo, però, comprende il senso di giustizia del ragazzo e lo lascia proseguire verso la Oscorp Tower. Mentre Gwen fugge dall'edificio sotto esortazione del padre, Peter comincia ad affrontare Lizard e nella battaglia l'eroe ha la meglio e riesce a diffondere l'antidoto. Connors ritorna normale e, mentre Peter sta per precipitare dal palazzo, il dottore lo salva riuscendo ad afferrarlo, conscio di aver sbagliato e di essere stato vittima della sua follia. Ma il padre di Gwen Stacy muore per mano di Lizard nel tentativo di aiutare Peter. Prima di spirare, il capitano della polizia di New York fa promettere a Peter di non coinvolgere più sua figlia nella sua doppia vita. Connors viene arrestato e Peter, così, è costretto a lasciare la ragazza, ma in seguito deciderà di continuare a frequentarla poiché non riesce a mantenere quella promessa.
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